产品货号：
YT393
中文名称：
BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)
英文名称：
BalbRT M-MuLV Reverse Transcriptase(RNase H-)
产品规格：
2000U
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本产品是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶(RNase H-)。和普通的M-MuLV反转录酶相比，BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成；但缺失了Ribonuclease H(RNase H)酶活性，不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA。BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)是最常用的反转录酶之一。
- BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)可以合成长达13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)仅能合成长达9kb的cDNA；
- BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)的最适反应温度为42～45℃并且在55℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。
- BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。
- BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
- BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)也可以用于DNA探针的标记，通过引物延伸(primer extention)来分析RNA，以及用于基因芯片荧光探针的标记。
本BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)由大肠杆菌表达，表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片段。
One unit of the enzyme incorporates 1nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10min at 37℃。
活性检测条件：
50mM Tris-HCl(pH8.3),6mM MgCl2,10mM DTT,40mM KCl,0.5mM dTTP,0.4 MBq/ml [3H]-dTTP,0.4mM polyA·oligo(dT)12-18。
| 组分 | 规格 |
| BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-) | 2000U |
| 5×Reaction Buffer | 200μL |
保存：-20℃。
本产品中M-MuLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl，用于20μL反转录体系时足够进行10次反转录反应。
50mM Tris,pH8.3,100mM NaCl,1mM EDTA,5mM DTT,0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。
5×Reaction Buffer：
250mM Tris(pH8.3@25℃)，250mM KCl，20mM MgCl2，50mM DTT。
不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
- 70℃孵育10分钟可以导致BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)失活；
- EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)有抑制作用。
一、cDNA第一条链的合成
- 参考如下表格设置反转录反应：
成分 用量 模板(后面3种任选一种) Total RNA 0.01～5μg 或Poly(A) RNA/mRNA 1～500ng 或Specific RNA 0.01pg～500ng 引物(后面3种任选一种) Oligo(dT)18 0.5μg (或100pmol) random hexamer 0.2μg (或100pmol) Gene specific primer 15～25pmol DEPC-treated Water 至13.7μL① 5×Reaction Buffer 4μL RNase Inhibitor 0.5μL② dNTP Mix (25mM each) 0.8μL③ BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-) 1μL 总体积 20μL
①至13.7μL表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μL。
注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，加入DEPC-treated Water混匀后微离心，接着可以在65℃孵育5分钟，随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
② RNase Inhibitor可以视其本身的情况加入适当的量，例如0.5μL或其他适当体积。在加入其他体积时，DEPC-treated Water的用量需适当调整。
③ dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。 - 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。
- 如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用random mhexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。
注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。 - 70℃孵育10分钟以失活BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。
说明：对于长片段的cDNA不推荐采用加热的方法失活BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)，这种操作可能会导致部分长片段DNA被剪切。 - 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为50μL，则推荐使用2μL反转录产物。
- 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。 - 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
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